TALEN基因编辑

2012年的斑马鱼活体基因编辑是多么火啊，当时还特别去学习了一下，做了以下的笔记。

分子生物学的基础和兴起离不开各种酶的发现和抗体的制备。没有抗体，蛋白质就玩不转，没有限制性内切酶和连接酶，就没有基因工程，如果没有耐高温酶的发现，连PCR都是件痛苦的事情，写到这里，我突然觉得做细菌也是蛮好的，因为比较有可能发现一些功能比较奇特的蛋白，而这些蛋白，一经改造，可能就是技术上的革新。

TALE(transcription activator-like effector)也不例外，最初在植物致病菌黄单胞菌（Xanthomonas）中被发现，在致病过程中，能够特异性地结合和调控植物基因。

TALE的结构中间 (红色部分) 是重复序列，介导DNA识别，每一个重复片段为33-35个氨基酸，其中12和13位置两个氨基酸决定碱基偏好性，这两个相邻的氨基酸被称之为重复可变双残基（repeat variable di-residue, RVD），RVD所编码的靶标碱基由上图b所示，基本上你看一段TALE的重复序列，就可以预测到它将结合到什么样的DNA序列上，或者你看一段DNA序列，可以很容易地设计结合它的TALE重复序列。

N端通常是288个残基，其中Δ152做为截断点，去掉前面用于进入植物细胞的功能，而保留TALE蛋白的其它功能。C端通常是278个残基。

中间重复片段的特性使得TALE很容易被改造，应用于各种定点靶向的场景。

Activator

2011年发表在NBT上的文章《A TALE nuclease architecture for efficient genome editing》将TALE改造成促进特定基因表达。将天然TALE进行PCR扩增，去掉前面152个残基，重复序列改造为结合NTF3的启动子邻近区域(proximal promoter)，C端连上VP16（转录激活结构域），结果诱导超过20倍的表达。NTF3基因编码一个分泌性的生长因子，对神经退行性疾病有一个的治疗功效。作者把C端截断，保留95个残基再接上VP16，同样也是mRNA超过20倍的表达。

Nuclease

位点特异性的核酸酶是基因组工程的有力工具，产生断裂的双链DNA（double strand breaks, DSBs），可以进行同源重组、靶向插入、删除。锌指蛋白（zinc finger protein）连接FokI的水解结构域，构成了锌指核酶(zinc finger nuclease, ZFN)被用来进行基因组编辑，但是ZFN的特异性和效率较差，可重复性不好。

TALE的单碱基识别能力，显然在特异性上是无可比拟的，有了TALE，TALEN（TALE-nuclease，TALE接上核酸酶）技术应运而生，特异性好，效率高，而且可以应用于各种物种。TALEN通常以同二聚体（homodimer）或异二聚体（hterodimer）对DNA从两端进行切割，两端切割点的距离（spacer length）可以是10-30bp之间，取决于linker的长度，即连接重复结构域和切割结构域的长度，长的linker，需要长的spacer，反之亦然。

两端切割后，产生DSB，就会引起系统对其进行修复，Miller等使用TALEN对NTF3基因进行切割，产生DSB，随后进行非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）修复，NHEJ在没有同源序列做为模版的情况下进行修复，这是一个不精确的修复途径，结果产生了3-30bp的删除。

NHEJ是容易出错也不好控制的，可喜的是还存在一条精确可控的途径，同源依赖修复（homology dependent repair, HDR），在有供体ssDNA存在的情况下，通过HDR途径，可以对基因进行编辑，插入和缺失处理。

于是牛B的事情就产生了，2012年Nature的文章报道在斑马鱼活体组织里使用TALEN技术，引入了定制的EcoRV位点和修改的loxP序列。